Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основной целью данного проекта является -идентификация и изучение новых консервативных ДНК-связывающих факторов, участвующих в привлечении репрессоров группы Polycomb (PcG) на хроматин у человека и Drosophila melanogaster (как модельной системы). Одной из задач первого года проекта было исследование обнаруженных ранее в нашей группе ДНК-связывающих белков Drosophila melanogaster: CG17829, Pad и CG32767. Получены качественные поликлональные антитела к белку CG17829. Используя данные антитела в экспериментах по иммунопреципитации хроматина (X-ChIP) мы показали, что CG17829 ассоциирован с рядом известных PRE-элементов генома Drosophila melanogaster. C помощью метода редактирования генома CRISPR/Cas9 получена делеция гена pad - кодирующая область гена была заменена на attP-сайт. С использованием антител к белку Pad установлен его полногеномный профиль связывания ДНК (ChIP-seq анализ) на эмбриональной стадии развития Drosophila melanogaster. Обнаружено 1702 участка связывания Pad, при этом многие пики перекрываются с хорошо охарактеризованными PRE-элементами (участками ДНК, на которые рекрутируются белки PcG). Методом дрожжевого двугибридного анализа был проведен поиск прямых партнеров Pad среди белков PcG. В результате обнаружено сильное взаимодействие между белками Pad и Sce – коровым компонентом комплекса PRC1. Для белка CG32767 методом pull-down подтверждена его способность взаимодействовать с PcG-фактором Sfmbt. Установлены минимальные области белков CG32767 и Sfmbt, необходимые для взаимодействия. В области теломерных повторов третьей хромосомы Drosophila melanogaster обнаружен элемент генома CR40450, который, вероятно, неправильно аннотирован как псевдоген и может являться функциональным паралогом CG32767. С использованием системы attP/attB, позволяющей встраивать трансгены в одну и ту же точку генома (attP2), созданы и проанализированы трансгены, несущие элемент bxdPRE с нативным или мутированным сайтом связывания CG32767. Установлено, что мутация сайта CG32767 приводит к полной потере репрессии маркерного гена white. Второй задачей первого года проекта была идентификация новых потенциальных рекрутеров методом иммунопреципитации с последующим высокочувствительным пептидным секвенированием. Был обнаружен новый партнер PcG-белка Sfmbt - фактор Hangover, имеющий в своем составе 19 ДНК-связывающих мотивов «цинковые пальцы» С2Н2-типа. В ходе первого года проекта был обнаружен и исследован новый PRE-элемент из генома Drosophila virilis. К данному элементу легко подобрать уникальные праймеры, не встречающиеся в геноме Drosophila melanogaster. Обнаруженный PRE-элемент обуславливает сильную репрессию маркерного гена white при инсерции в геном Drosophila melanogaster и взаимодействует с PcG-белками комплексов PRC1 и PhoRC (https://journals.eco-vector.com/0869-5652/article/view/11778). Исследована способность проходящей транскрипции блокировать активность интрон-расположенного энхансера (https://journals.eco-vector.com/0869-5652/article/view/12569). Для PcG-репрессоров человека - CBX2, CBX4, CBX6, CBX8, L3MBTL2, Th-POK и HINFP (гомолог белка CG17829 Drosophila melanogaster) - получены антитела и/или сыворотки. Проведен поиск гомологов белков с мотивами «цинковые пальцы» С2Н2-типа в геноме человека, которые имеют схожие домены с факторами Pad и CG32767. Для выявленных факторов - ZNF167, ZNF407, ZNF546, ZNF33A и ZNF273 - созданы плазмиды, несущие фрагменты данных белков, для последующего получения поликлональных антител.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Представленный проект направлен на поиск и исследование ДНК-связывающих факторов, участвующих в привлечении репрессоров группы Polycomb (PcG) на хроматин. В ходе выполнения второго года проекта получены новые данные о рекрутерах человека. Методом дрожжевого двугибридного анализа установлены взаимодействия между PcG-белком L3MBTL2 и двумя ДНК-связывающими факторами - ZNF281 и ZFP64. Потенциально ДНК-связывающие белки, взаимодействующие через L3MBTL2 могут играть ключевую роль в привлечении L3MBTL2 и других белков Polycomb на хроматин у человека. Так, ранее важная роль в рекрутировании была продемонстрирована для комплекса PhoRC Drosophila, который включает паралог L3MBTL2 – белок Sfmbt и ДНК-связывающие субъединицы. В ходе проекта мы также продемонстрировали взаимодействие между ДНК-связывающим фактором ZNF76 и одним из компонентов репрессорного комплекса PRC2 – PHF19, что предполагает, что ректутирование потенциально может также осуществляться и через другие факторы. Установлены взаимодействия между белками ZFP64 - ZNF76 и ZNF281 - ZNF76, что поддерживает идею кооперативного связывания рекрутеров и PcG-факторов с хроматином (модель «платформы»). Продемонстрировано, что белки ZNF76 и ZFP64 могут взаимодействовать со своей копией в двугибридной системе. На модели дрозофилы исследованы свойства ДНК-связывающих белков CG32767, CG17829 и Pad. Для белка CG32767 методом ко-иммунопреципитации показано взаимодействие с ключевыми PcG-белками – Sfmbt и E(z). Продемонстрировано, что мутация сайтов связывания CG32767 в ДНК-последовательности bxdPRE приводит к полному нарушению репрессии маркерного гена в трансгенных мухах. Проведен ChIP-seq анализ для определения полногеномного профиля связывания белка Pad на стадии личинки и показана колокализация Pad со многими PRE-элементами. Методом иммунопреципитации с последующим высокочувствительным масс-спектрометрическим анализом (IP/MS) был исследован интерактом фактора CG17829. В качестве основных партнеров выявлены белки группы Trithorax: Osa, Trx, Brm, Snr, Mor. Продемонстрирована роль CG17829 в рекрутировании факторов Trx, Osa на хроматин: методом иммунопреципитации хроматина показано, что на фоне мутации по CG17829 происходит падение связывания Osa и Trx с PRE-элементами. Проведен масштабный мета-анализ нарушений Polycomb-комплекса PRC2 (белки EZH2/SUZ12/EED) при различных онкологических патологиях у человека с использованием различных баз данных. Идентифицированы основные типа рака, при которых наблюдается нарушение активности EZH2/SUZ12/EED.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Настоящий проект направлен на исследование белков группы Polycomb как мишеней для разработки новых подходов для терапии онкологических заболеваний. В ходе выполнения третьего года проекта исследованы интерактомы двух ДНК-связывающих факторов: ZNF281 и ZNF131, a также белка EZH2 комплекса PRC2. Для этого применялся метод иммунорпеципитации с последующим высокопроизводительным пептидным секвенированием всего пула выделенных белков методом LC-MS. В случае белка ZNF131 были получены наиболее интересные результаты. Во-первых, топовые партнеры ZNF131 представлены компонентами хроматин-ремоделирующего комплекса SWI/SNF (группа Trithorax) - белками SMARCA5, SMARCA4, SMARC1, SMARCC2 и др. Во-вторых, в топе взаимодействий детектируется Polycomb-фактор SCML2. Кроме того, два других компонента из группы PcG – белки RING2 и PHC2 – также детектируются в IP. Как и ZNF131, ZNF281 ассоциирован с SCML2, а также с белком PRC1-комплекса RING1. Для белка EZH2 показано взаимодействие c ДНК-связывающим фактором ZNF24. На дрозофилиной модели методом иммунопреципитации-масс-спектрометрии установлены белковые партнеры сразу четырех ДНК-связывающих факторов, ассоциированных с системой Polycomb, - Zeste, Adf1, Combgap и Psq. Показано, что, кроме контактов с Polycomb-факторами, данные белки имеют свои уникальные наборы взаимодействий. Adf1 преципитирует все компоненты медиаторного комплекса субъединиц «голова», «тело» и «хвост». Антитела против Combgap эффективно преципитируют промотор-ассоциированные факторы комплексов NELF и TFIID. Psq из всех четырех протестированных факторов наиболее сильно взаимодействует с хроматин-ремоделирующим комплексом SWI/SNF. Кроме того, антитела против Combgap эффективно преципитируют Adf1 и GAF. Psq и Zeste взаимодействуют друг с другом, как и с двумя другими PRE-ассоциированными ДНК-связывающими факторами – Dsp1 и Fs(1)h (dBRD4). В связи с присутствием разных PRE-связывающих белков в инетрактомах друг друга мы протестировали возможность образования прямых белок-белковых взаимодействий между исследуемыми ДНК-связывающими факторами методом дрожжевой двугибридной системы. Как и ожидалось, были обнаружены несколько прямых контактов: Combgap - Adf1, Psq – Dsp1, Pho – spps. Таким образом, полученные данные полностью согласуются с выдвинутой нами в заявке моделью «платформы» как механизма специфичного рекрутирования репрессоров системы Polycomb на хроматин. Наконец, мы провели подробный анализ делеций компонентов комплекса PRC2 (Polycomb repressive complex 2) в раковых линиях человека (данные были взяты из проекта DepMap) c целью выявления типов опухолей, для которых могла бы подойти терапия, основанная на разработанных ингибиторах PRC2. Обнаружено, что наибольшую чувствительность к делециям генов коровых компонентов PRC2 (EZH2, SUZ12 и EED) имеют клетки из линий лимфоидных новообразований. Более того, линии с GOF-мутациями EZH2 обладали наибольшей чувствительностью к подавлению активности PRC2. На следующем этапе мы проанализировали данные DepMap на предмет корреляций между наличием мутаций вторичных генов и их чувствительностью к делециям PRC2-кодирующих генов в 777 раковых линиях. Для этого был разработан уникальный компьютерный алгоритм, позволяющий количественно обсчитать зависимости между наличием мутаций и чувствительностью раковых клеток (доступен на портале GitHub https://github.com/genesolution/PRC2_data). Помимо мутаций генов, кодирующих субъединицы комплекса SWI/SNF (что было известно ранее), к гиперчувствительности раковых клеток приводят мутации в других генах (компоненты COMPASS и COMPASS-like комплексов, ряд Polycomb-ассоциированных факторов и др.). При этом для трех генов показаны значимые корреляции в случае делеции любого из трех коровых компонентов PRC2-комплекса. Таким образом, нами были выявлены гены, нарушения которых могут потенциально быть использованы в качестве маркеров эффективности применения терапии, основанной на низкомолекулярных ингибиторах PRC2.. В будущем полученные данные могут иметь важное значение для персонализированной медицины при применении препаратов, подавляющих активность PRC2.